[Tutorial] Chuyên đề xử lý mẫu phân tích-Chương 2

+        Chất hấp phụ pha khí-rắn (purge and trap extraction)

Chính vì có nhiều loại pha tĩnh như thế nên kỹ thuật chiết pha rắn cũng có nhiều cơ chế và quá trình động học khác nhau, theo bản chất mỗi cơ chế đó. Sau đây là một số cơ chế và điều kiện chọn hệ chiết (pha tĩnh và pha động). Nói chung pha tĩnh trong chiết pha rắn cũng tương tự như pha tĩnh trong HPLC.

–          Các điều kiện của chiết pha rắn

Quá trình chiết ở đây thực chất vẫn là quá trình phân bố của một chất trên hai pha tĩnh (pha rắn) và động (pha lỏng hay khí) trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ, pH, tốc độ chảy dung môi qua cột chiết. Như vậy hệ số phân bố KDcủa một chất trên hai pha cũng là yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết. Tóm lại phải có các điều kiện sau đây

+        Pha tĩnh hấp phụ hay trao đổi chọnn lọc với một nhóm chất phân tích

+        Hệ số KD phải lớn

+        Quá trình chiết xảy ra nhanh, đạt cân bằng nhanh

+        Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch cao để rửa giải thuận lợi

+        Sự chiết được thực hiện trong một điều kiện nhất định, càng đơn giản càng tốt.

–          Chiết theo cơ chế hấp phụ pha thường

Trong kiểu chiết này, pha rắn là các silica trung tính, có bề mặt phân cực. Nó áo dụng tốt với các chất mẫu không phân cực và ít phân cực. Đó là sự tương tác hấp phụ của pha tĩnh: chất chiết rắn trong cột. Tùy theo bản chất và cấu trúc phân tử mỗi nhóm chất phân tích và bản chất hấp phụ của silica trung tính và các điều kiện thực hiện sự tách mà nhóm chất phân tích nào bị pha tĩnh hấp phụ và bị giữ lại trên cột. Cơ chế của sự tương tác này hoàn toàn tương tự như cơ chế tương tác trong HPLC pha thường. Sau đây là minh họa của tương tác

Dung môi rửa giải chất phân tích trong loại này thường là các dung môi hữu cơ không hay ít phân cực và kỵ nước hoặc hỗn hợp của chúng theo tỷ lệ thích hợp. Ví dụ: n-hexane, n-heptane, CCl4, CHCl3, CH2Cl2, benzene… Các dung môi này được gọi là pha động và phải hòa tan tốt chất phân tích.

+ Ví dụ 1: Chiết để xử lý mẫu xác định nhóm hợp chất chlorophenol trong nước. Acid hóa 250 mL mẫu đến pH 2 bằng H2SO4 10%, sau đó dội mẫu này qua cột chiết loại LASi-5 tốc độ 4 mL/phút. Dội qua cột 10 mL nước cất, giải hấp bằng 40 mL acetonitril hay dichloromethane và xác định bằng HPLC hay GC.

+ Ví dụ 2: Chiết để xử lý mẫu xác định một số hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs) hay một số pesticides trong nước thải. Acid hóa 250 mL mẫu bằng H2SO42% đến pH= 6, lọc bỏ cặn nếu có, dội dung dịch này qua cột loại SiOH với tốc độ 4 mL/phút. Giải hấp chất phân tích bằng ACN hay DCM. Xác định các chất phân tích bằng GC hay HPLC

– Chiết theo cơ chế hấp phụ pha ngược

Trong kiểu chiết này, pha tĩnh là Silica được alkyl hóa nên có bề mặt không phân cực. Nó tương hợp tốt với các chất không phân cực hay phân cực kém. Tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích (độ phân cực, kích thước, cấu trúc), pha tĩnh (độ phân cực, diện tích bề mặt riêng…) và pha động (độ phân cực, thành phần, tốc độ chảy…). Tương tác này tương tự với tương tác của pha tĩnh-pha động-chất tan gặp trong HPLC pha đảo. Dung môi rửa giải sử dụng trong kiểu chiết pha rắn pha đảo này là các dung môi có tính phân cực như nước, acetonitril, methanol, ethylacetate… Minh họa các tương tác pha tĩnh-pha động-chất tan như sau

+ Ví dụ 1: Chiết để xử lý mẫu xác định nhóm hợp chất chlorophenol trong nước. Acid hóa 250 mL mẫu đến pH 2 bằng HNO3 1N, ly tâm bỏ cặn, sau đó dội mẫu này qua cột chiết loại Baker-10 TPE-phenyl column, 6 mL No. 7095, tốc độ 3 mL/phút. Rửa cột bằng 10 mL HNO3 0.01N, giải hấp bằng 40 mL acetonitril và xác định bằng HPLC, GC hay GCMS.

+ Ví dụ 2: chiết để xử lý mẫu xác định nhóm các kim loại (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn) trong nước: thêm 1 mL thuốc thử Ultrex- 8-oxyquinolin vào 250 mL mẫu, chỉnh pH 8-9 bằng NH3 1N, lắc đều rồi dội mẫu qua cột Baker-10 C18SPE 5 mL với tốc độ 2-4 mL/phút. Rửa cột bằng 10 mL nước cất. Giải hấp các phức kim loại trên cột bằng 10 mL MeOH, xác định các nguyên tố trong pha MeOH bằng AAS. Để xác định kim loại, nên tro hóa ướt dịch chiết MeOH bằng HNO3. Có thể thay thuốc thử này bằng Na-diethyldithiocarbamate 0.1% trong EtOH.

+ Chiết để xử lý mẫu xác định một số thuốc BVTV trong nước. Lấy 250 mL mẫu nước, chỉnh pH 5, lọc bỏ cặn. Dội dung dịch qua cột chiết loại LR C18 với tốc độ 4 mL/phút. Rửa cột bằng 10 mL nước cất, hút chân không 5 phút. Rửa giải các chất BVTV trong cột bằng 20 mL EtOAc. Lấy dịch rửa giải này dội qua cột thứ 2 chứa Na2SO4-…-than hoạt tính, rửa giải bằng 10 mL EtOAc. Làm bay hơi dung dịch thu được bằng dòng khí Nitrogen đến khi dung dịch sánh, định mức thành 2 mL bằng EtOAc. Xác định các hóa chất BVTV bằng GC hay GCMS.

– Chiết theo cơ chế trao đổi ion và cặp ion.

          Nguyên tắc: dựa trên cơ sở của quá trình tương tác của chất phân tích với ion đối (của chất trao đổi ion-pha tĩnh). Chất phân tích sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh và sẽ được rửa giải bằng một pha động thích hợp.

Chất trao đổi ion của kiểu chiết này có thể có hai loại sau

Support-SO3Na + Men+  → support-(SO3)nMe + n Na+

                                      Support-NR3OH + Xn- → support-(NR3)nX + nOH–

Trong quá trình trao đổi, tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích và pha tĩnh mà quá trình có thể được thực hiện tốt trong một khoảng pH nhất định nào đó.

Cùng với sự trao đổi anion và cation; trong sự chiết pha rắn còn có cơ chế chiết theo kiểu cặp ion (ion-pair). Nó cũng hoàn toàn tương tự như sắc ký cặp ion của hệ pha đảo (RP-HPLC). Pha tĩnh ở đây là chất trao đổi pha ngược.

Cơ chế trao đổi cặp cation

+ Ví dụ 1: Theo cơ chế trao đổi cation. Chiết tách các kim loại nặng (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn) trong mẫu nước khoáng, nước mỏ, nước thải… Acid hóa 250 mL mẫu nước đến pH 4, lọc bỏ cặn. Nạp mẫu vào cột chiết (chelex-100, dạng H+) với tốc độ 3-4 mL/phút. Giải chiết các kim loại trong cột bằng 10 mL HNO32.5M. Xác định chúng bằng AAS hay ICP.

+ Ví dụ 2: Theo cơ chế trao đổi anion. Chiết tách lấy các anion nhóm halogen, sulfate, nitrate… trong nước. Lấy 250 mL mẫu nước, chỉnh pH = 8, lọc bỏ cặn, dội qua cột chiết loại SPE.OH, 5 µm, 6 mL với tốc độ 2-4 mL/phút. Rửa giải chất phân tích bằng 10 mL NaOH 0.5M và xác định các anion Cl-, Br-, NO3-, sulfate… trong dung dịch này.

+ Ví dụ 3: theo cơ chế tạo cặp trao đổi cation. Chiết tách lấy các ion kim loại nặng trong nước thải bằng R-C18. Lấy 250 mL mẫu nước, chỉnh pH 5, lọc bỏ cặn, thêm chất tạo cặp ion rồi dội dung dịch mẫu qua cột chiết loại Hypersil ODS 5 µm, 6 mL, tốc độ 2-4 mL/phút, sau đó rửa giải chất cần phân tích bằng 10 mL dung dịch HIBA 0.25%, pH 4-5 hay EDTA, pH =5.

+ Ví dụ 4: theo cơ chế tạo cặp trao đổi anion: chiết tách các anion nhóm halogen, nitrate, sulfate … trong nước thải. Lấy 250 mL mẫu nước, chỉnh pH =8.5, lọc bỏ cặn, thêm chất tạo cặp ion rồi dội dung dịch mẫu qua cột chiết loại Hypersil R-NOH 5 µm, 6 mL, tốc độ 2-4 mL/phút, sau đó rửa giải chất cần phân tích bằng 10 mL dung dịch NaOH 0.2-0.3N.

–          Chiết theo cơ chế sàng và rây phân tử

Nguyên tắc: chất chiết ở đây là các hạt silica (pha thuận hay pha đảo) có lỗ xốp lớn. Sự tách chiết theo kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của chất phân tích khi mẫu được cho qua pha tĩnh trong cột chiết. Các phân tử kích thước nhỏ sẽ bị dồn ép vào phía sâu trong cùng của lỗ xốp, các phân tử kích thước lớn sẽ ở phía ngoài. Các phân tử có kích thước to hơn lỗ xốp sẽ nằm bên ngoài hạt pha tĩnh. Như vậy khi rửa giải, các phân tử to sẽ được rửa giải ra trước và tuần tự theo đó sẽ là các phân tử có kích thước nhỏ dần. Đây chính là cơ sở của sự tách chiết theo bằng kỹ thuật sàng và rây phân tử.

Các quá trình và ví dụ:

+ Ví dụ 1: chiết tách các nucleobazide trong mẫu dịch sinh học. Lấy V mL mẫu, nhũ hóa và đồng nhất bằng 50-100 mL hỗn hợp dung môi MeOH-ACN. Lắc kỹ và gạn lấy dịch trong, dội qua cột chiết Backer 10 SPE-P, 6 mL với tốc độ 3-4 mL/phút. Giải hấp chất phân tích bằng 20 mL DCM. Xác định bằng HPLC hay MKEC.

+ Ví dụ 2: chiết tách các chất của nhóm protein. Lấy V mL mẫu, nhũ hóa và đồng nhất bằng 50-100 mL hỗn hợp dung môi MeOH-ACN 8:2. Lắc kỹ và gạn lấy dịch trong, dội qua cột chiết Backer 10 SPE-P, 6 mL với tốc độ 3-4 mL/phút. Giải hấp chất phân tích bằng 20 mL DCM. Xác định bằng HPLC hay MKEC.

Ưu nhược điểm và phạm vi sử dụng chiết pha rắn

Chiết pha rắn là kỹ thuật chiết mới ra đời, đang phát triển và được ứng dụng trong khoảng vài chục năm trở lại đây nhất là ở các nước tiên tiến. Nhiều loại pha rắn và các dụng cụ chiết khác nhau đã được thương mại hóa. Các pha rắn thuờng dựa trên nền silica đã hoạt hóa, biến tính để tăng độ chọn lọc và dung lượng trao đổi. Kỹ thuật này có một số ưu nhược điểm sau

+ có tính chọn lọc với các hợp chất hữu cơ vì thế thích hợp cho phân tích vết

+ Thao tác đơn giản, nhanh hơn các kỹ thuật khác

+ Trong quá trình chiết có cả sự làm giàu chất phân tích.

Kỹ thuật này dựa trên cơ sở là ở một nhiệt độ thích hợp, khi thổi một dòng khí trơ nóng (Ar hay He) vào dung dịch mẫu, một nhóm chất phân tích sẽ bị bay hơi và lôi cuốn theo dòng khí trơ đến cột hấp phụ, tại đây chất phân tích sẽ bị giữ lại trên pha tĩnh trong khi các chất khác đi qua. Vì thế về bản chất nó cũng là sự chiết giữa hai pha khí và rắn theo cơ chế hấp phụ. Để giải hấp, cột được gia nhiệt và chất phân tích bay ra khỏi bề mặt pha tĩnh và theo dòng khí trơ đi vào máy phân tích (GC) hay hấp thu vào một dung môi hữu cơ phù hợp cho các phép phân tích khác như HPLC hay UV-VIS. Phương pháp này được dùng cho các mẫu rắn và lỏng, bùn hay bã thải nhưng chỉ thích hợp cho các chất có nhiệt độ bay hơi thâp (< 150oC). Như thế tùy vào việc lựa chọn pha tĩnh và nhiệt độ mà người ta có thể tách được các nhóm chất ra khỏi nhau sau đó phân tích chúng theo các phương pháp phù hợp. Cách này rất thích hợp cho việc tách chiết các chất hữu cơ trong các mẫu rắn (bột, bùn, nhão). Tất nhiên việc trước tiên phải nhũ hóa các mẫu này bằng một dung môi thích hợp như nước hay một dung môi hữu cơ nặng có nhiệt đội sôi cao. Pha tĩnh thường là các chất hấp phụ dựa trên silica như silica trung tính hay biến tính tương tự như các hệ NP-HPLC, RP-HPLC.

Theo kỹ thuật này trang thiết bị cũng có hai loại là hệ đơn giản và hệ hoàn chỉnh, tự động được theo chương trình định sẵn. Khí mang sử dụng là Ar, He hay N2tinh khiết > 99.9%.

Ví dụ 1: chiết một số hydrocarbon dễ bay hơi trong các loại nước hay mẫu rắn: cột hấp phụ là pha rắn DSC 25×1 cm (DSC: diphenylene oxide polymer-silicagel-coconut charcoal 1:1:1), mẫu được giữ trong bình cầu và dòng Ar thổi qua bình mẫu với tốc độ 0.8-1.0 mL/phút để đưa chất phân tích vào cột hấp phụ. Các chất hữu cơ benzene, bromobenzene, bromomethane, bromoethane, chloromethane, chloroethane, ethylbenzene… sẽ được hấp phụ vào cột này. Việc giải hấp được tiến hành bằng dòng khí trơ Ar gia nhiệt ở 180oC và dẫn trực tiếp vào máy GC, GCMS hay vào một dung môi phù hợp như n-hexane dùng để xác định bằng một phương pháp khác.

+ Ví dụ 2: chiết lấy một số hợp chất pesticides dễ bay hơi trong các loại nước hay mẫu rắn, bùn (method 502,2b). Cột hấp phụ là pha rắn LC2 25×1 cm. Mẫu được giữ lở 150oC và dòng khí Ar thổi qua mẫu với tốc độ 0.8-1 mL/phút để chuyển chất phân tích vào cột hấp phụ. Giải hấp các chất hấp phụ bằng dòng Ar ở nhiệt độ 200oC trực tiếp vào máy GC hay GCMS.

Kỹ thuật này rất thích hợp cho việc xử lý các loại mẫu để xác định các chất hữu cơ có nhiệt độ sôi < 200oC và dễ bay hơi trong các loại mẫu rắn, bùn, bã thải. Nó có ưu điểm là chọn lọc cho mỗi nhóm chất tùy vào chất phấp phụ, thích hợp cho các phương pháp phân tích HPLC, GC, GCMS nên được sử dụng chủ yếu cho phân tích vi lượng các chất hữu cơ trong các loại mẫu khác nhau.

2.4.5.1. Nguyên tắc chung:chưng cất là kỹ thuật tách dựa trên sự khác biệt về điểm sôi của các chất theo đó có thể lấy được một chất hay một nhóm chất dựa vào mức độ sai biệt về nhiệt độ sôi, trang thiết bị và điều kiện (nhiệt độ) chưng cất. Có nhiều kiểu chưng cất khác nhau như:

– Chưng cất thông thường

– Chưng cất lôi cuốn hơi nước

– Chưng cất áp suất thấp (cô quay chân không).

–          Ví dụ 1: chưng cất để lấy MeOH tinh khiết từ MeOH bẩn. MeOH có nhiệt độ sôi là 64.5oC nên sẽ chưng cất được MeOH tinh khiết nếu thu dịch chưng cất tại phân đoạn có nhiệt độ này.

–          Ví dụ 2: Chưng cất lấy acetone từ hỗn hợp acetone và MeOH bẩn. Aceton có nhiệt độ sôi là 56.5oC nên khi chưng cất chúng ta chỉ lấy phân đoạn tại nhiệt độ này.

–          Ví dụ 3: chưng cầt mẫu xác định hàm lượng NH4+. Lấy 10 g mẫu đã nghiền mịn cho vào bình chưng cất, thêm 100 mL NaOH 10%, lắc đều, đun sôi nhẹ, thổi một dòng N2 sạch qua bình chưng cất, dẫn hơn NH3 sinh ra sang bình hấp thu là dung dịch H2SO40.1 N. Chuẩn độ lượng acid dư, chúng ta sẽ tính được hàm lượng NH4+hay N trong mẫu.

Nguyên tắc: Đây là quá trình chưng cất tinh chế và tách các chất cũng dựa vào điểm sôi của chúng để tách các chất theo từng phân đoạn trong những điều kiện nhất định theo nhiệt độ sôi và bay hơi khi chưng cất. Tuy nhiên trong trường hợp này chất phân tích cần chưng cất không bay hơi một mình mà phải có một chất khác có nhiệt độ sôi gần hay bằng chúng để lôi cuốn chúng theo. Sản phẩm lôi cuốn là một dung dịch hỗn hợp có hòa tan chất cần phân tích. Ví dụ để cất lấy cresol,formaldehyde; người ta phải chưng cất lôi cuốn nó cùng với hơi nước, sau đó mới xác định chúng từ dung dịch này hay tách chúng ta khỏi nước bằng cách chiết lỏng-lỏng hay chiết lỏng-rắn trước khi phân tích.

Các cách thực hiện và ví dụ.

–                      Ví dụ 1: chưng cất bằng lôi cuốn hơi nuớc lấy formaldehyde từ bánh phở, bún… Lấy 20 g vào cối mã não, thêm 20 mL nước cất, nghiền mịn, trộn đều, cho vào bình chưng cất, tráng cối bằng 20 mL nước cất, thêm 60 mL nước cất nữa (cho đủ 100 mL), lắc đều, lắp ống sinh hàn và chưng cất từ từ trong 30-40 phút, thu được 50 mL dịch chưng cất. Dung dịch cất này dùng để xác định formaldehyde bằng phổ UV-VIS hay HPLC hay GCMS.

–                      Ví dụ 2: chưng cất lấy tinh dầu bạc hà nhờ lôi cuốn hơi nước. Lá bạc hà được cắt nhỏ, cho vào bình chưng cất, thêm nước cho ngập lá (1 kg là, 1.5 L nước). Chưng cất cho đến khi thu được 60% dung dịch thì dùng. Dùng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách tinh dầu ra khỏi nước vào dung môi hữu cơ. Cách này có thể vừa được dùng cho mục đích phân tích vừa được dùng cho mục đích điều chế sản xuất.

                        a. Nguyên tắc chung: Đây là quá trình chưng cất để tinh chế các chất dựa theo điểm sôi của chúng mà tách các chất theo từng phân đoạn trong những điều kiện nhiệt độ nhất định ở áp suất thấp (khống chế bằng bơm chân không) nhằm tách các hợp chất kém bền nhiệt. Trong điều kiện này nhiệt độ hóa hơi của chất phân tích sẽ hạ thấp, quá trình chưng cất sẽ nhanh hơn mà lại có hiệu quả tách tốt hơn. Khác với điều kiện thông thuờng, ở áp suất thấpcác chất sẽ có nhiệt độ sôi và bay hơi khác nhau vì thế sau chưng cất phải thử lại từng phân đoạn xem chất phân tích hiện diện ở đâu. ???

                      b. Trang bị và cách thực hiện: Để xử lý theo kỹ thuật này, phải trang bị hệ thống máy cô quay và máy bơm chân không để điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thấp thích hợp. Sau đây là một vài ví dụ.

– Ví dụ 1: chưng cất làm bay n-hexane để lấy chất phân tích nhóm Vitamin A và Caroten bằng cất quay chân không. Lấy 10 g mẫu đã nghiền nhỏ vào phễu chiết, thêm 20 g Na2SO4khan, 100 mL dung môi THF hay n-hexane. Lắc kỹ trong 10 phút, lọc qua phễu Busner, lấy dung dịch cho vào và cho vào bình cất của máy cô quay để cất cho dung môi bay hơi đến khi còn bã ẩm, để nguội. Hòa tan bã này trong 5 mL MeOH, dung dịch này dùng để xác định Caroten bằng HPLC.

– Ví dụ 2: Chưng cất tách MeOH tinh khiết từ MeOH kỹ thuật (nguyên liệu thô) và thu lấy bã còn lại để xác định một số tạp chất có trong MeOH kỹ thuật. Lấy 200 mL MeOH vào bình chưng cất, lắp hệ thống cô quay chân không và chưng cất MeOH cho đến khi dịch lỏng trong bình chưng cất còn khoảng 2 mL, để nguội. Lấy bã này hòa tan trong 5 mL DCM, ly tâm hay lọc tách bỏ cặn. Xác định các tạp chất hữu cơ trong dịch lọc bằng GC, GCMS hay HPLC.